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　   近日，中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗室（LMB）研究員張長(cháng)生團隊在多環(huán)大環(huán)內酰胺類(lèi)天然產(chǎn)物生物合成酶學(xué)機制研究方面取得新進(jìn)展。相關(guān)成果 “A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates” 在線(xiàn)發(fā)表于A(yíng)ngewandte Chemie (《德國應用化學(xué)》) 

　　惰性C-H鍵活化是合成高價(jià)值化合物的關(guān)鍵環(huán)節，主要依靠過(guò)渡金屬催化，難以控制區域/立體/化學(xué)選擇性，一度被稱(chēng)為有機化學(xué)中的“圣杯”。而在自然界中，少數細胞色素P450酶可以輕松有序地催化多步C-H鍵活化反應，且具有高度的區域/立體/化學(xué)選擇性，是形成許多重要天然產(chǎn)物的關(guān)鍵環(huán)節。這些P450酶被稱(chēng)為多功能P450酶，是合成生物學(xué)應用的重要酶元件，但由于解析的復合物晶體結構有限，酶控制多步反應和精準選擇性的酶學(xué)機制仍有待闡明。以ikarugamycin為代表的多環(huán)大環(huán)內酰胺類(lèi)天然產(chǎn)物(PoTeMs)是藥物先導化合物和生物農藥的重要資源。在PoTeMs生物合成中，P450酶介導的后修飾極大豐富了化學(xué)結構和生物活性。有趣的是，其中的多功能P450酶IkaD和CftA被報道都天然識別ikarugamycin（1），但得到不同的氧化產(chǎn)物：IkaD先氧化C7=C8雙鍵形成環(huán)氧，再羥基化C29，獲得產(chǎn)物capsimycin G（1b）；而CftA先催化形成C29酮基，再微弱催化C30羥基化反應獲得產(chǎn)物clifednamide C（1d）（圖1）。 

　　為了揭開(kāi)P450酶IkaD和CftA催化功能差異的神秘面紗，研究團隊首先解析了IkaD和CftA與共同底物1的復合結構。發(fā)現二者的整體三維骨架基本重合，是典型的金字塔形P450骨架，但參與構成催化口袋的FG區域的構象明顯不同，從而影響了催化口袋的形狀（圖1），使得同一個(gè)底物1朝向兩個(gè)酶血紅素鐵反應中心的距離和角度不同（圖2），最終決定了酶催化反應的區域和化學(xué)選擇性。基于這一發(fā)現，研究團隊通過(guò)理性設計，對遠離血紅素鐵反應中心的極性氨基酸開(kāi)展單點(diǎn)突變，發(fā)現IkaD的部分突變酶能夠改變催化反應的區域選擇性，形成天然分離未發(fā)現過(guò)的人工新產(chǎn)物。 

　　圖1. 多功能P450酶IkaD和CftA對相同底物的不同區域/化學(xué)選擇性及其結構基礎 

　　接著(zhù)，研究團隊以不同骨架的PoTeMs底物開(kāi)展系統性的體外酶學(xué)測試，發(fā)現IkaD和CftA都能識別催化非天然底物，但與區域選擇性不同。分別解析IkaD和CftA與非天然底物的復合物晶體結構（圖2），發(fā)現非天然底物并沒(méi)有誘導IkaD和CftA發(fā)生構象變化，保持了二者FG區域的構象差異，最終決定了對非天然底物的位點(diǎn)選擇性和反應順序。有趣的是，遠離血紅素鐵反應中心的極性氨基酸突變也顯著(zhù)改變了IkaD對非天然底物催化反應的區域選擇性。 

　　圖2. P450酶與不同骨架的PoTeMs底物在IkaD和CftA晶體結構中的結合模式 

　　雖然參與組成P450酶催化口袋的BC和FG區域存在構象變化的現象已經(jīng)廣為人知，本研究首次發(fā)現了FG區域的構象差異導致同一底物1在IkaD和CftA催化口袋中以不同的姿勢朝向酶反應中心，造成了二者催化反應的區域選擇性和化學(xué)選擇性不同。這些發(fā)現為多功能P450酶如何控制位點(diǎn)選擇性、反應順序和反應類(lèi)型提供了蛋白三維晶體結構方面的解答，并為P450酶理性改造提供了參考，對于認知海洋天然產(chǎn)物生物合成途徑和豐富海洋微生物酶元件庫具有重要的科學(xué)意義。 

　　博士研究生蔣鵬和博士后金紅波為論文的第一作者，研究員張長(cháng)生和副研究員張麗萍為共同通訊作者。以上研究工作得到了國家自然科學(xué)基金項目、廣東省自然科學(xué)基金、廣州市科技計劃項目和海南省重大科技計劃項目等的資助。 

　　相關(guān)論文信息：Peng Jiang#, Hongbo Jin#, Guangtao Zhang, Wenjun Zhang, Wei Liu, Yiguang Zhu, Changsheng Zhang*, Liping Zhang*, A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates, Angewandte Chemie, doi.org/10.1002/anie.202310728 

　　文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202310728